北京時間2月19日24點，國際學術期刊Nature 在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（原生物化學與細胞生物學研究所）童明漢課題組聯合上海交通大學醫學院附屬新華醫院黃旲團隊的研究成果，題為“In vitro reconstitution of meiotic DNA double-strand break formation”。該研究基于體外表達和純化的小鼠SPO11-TOP6BL復合體，首次在體外成功重構了DNA雙鏈斷裂(Double-Strand Break, DSB)的形成，為解析減數分裂同源重組機制建立了研究平臺。
減數分裂是存在于有性生殖生物中的特殊細胞分裂方式，為有性生殖的基礎。同源重組是減數分裂中最重要的生物學事件，它不僅使來自親本雙方的遺傳物質發生交換，增加了物種遺傳的多樣性；而且還能讓同源染色體之間建立物理連接，以確保它們的精確分離，維持染色體數量的恒定。同源重組起始于程序性DSB的形成。早在1997年，研究發現Spo11為催化酵母減數分裂DSB形成的關鍵蛋白；并揭示其在切割DNA雙鏈后，會共價結合在DNA的5'末端。然而，如何在體外表達獲得有活性的Spo11，以及如何在體外重構減數分裂DSB形成過程，長期以來一直懸而未決，這一問題被譽為減數分裂同源重組研究領域的“圣杯”。
Spo11是一種高度保守的蛋白，屬于II B型拓撲異構酶家族中拓撲異構酶VI（Top6）家族。Top6由兩個催化亞基（Top6A）和兩個調控亞基（Top6B）構成異源四聚體，其活性依賴于Top6A 和Top6B的協同作用。SPO11為 Top6A的同源物；而TOP6BL作為Top6B的哺乳動物同源物，直到2016年才被發現，并被證明也為減數分裂DSB形成所必需。
為了解決體外重構減數分裂DSB形成這一難題，童明漢課題組利用體外蛋白表達純化系統成功獲得了SPO11-TOP6BL復合體，并首次在體外重現其切割DNA雙鏈的活性。之后，與新華醫院黃旲團隊合作，采用凝膠過濾層析、交聯質譜、Pull Down等方法，系統地研究了SPO11-TOP6BL復合體的生化特征；證實該復合體在溶液中主要以異源二聚體形式存在，只有極少部分能形成異源四聚體。接著進一步證明在切割DNA后，SPO11共價結合于切割產物的5’末端。于此，困擾領域近30年的體外重構減數分裂DSB形成難題迎刃而解。
分子細胞卓越中心湯辛哲博士生和合作的胡澤濤博士生為該論文共同第一作者；分子細胞卓越中心童明漢研究員和上海交通大學醫學院附屬新華醫院黃旲教授為該論文共同通訊作者。值得一提的是，美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心Scott Keeney團隊、比利時法語魯汶大學Corentin Claeys Bouuaert團隊分別在Nature上發表了背靠背文章“Reconstitution of SPO11-dependent double-strand break formation”和“SPO11 dimers are sufficient to catalyse DNA double-strand breaks in vitro”。Nature同期為三篇文章配發了由加利福尼亞大學圣迭戈分校Francisco Mendez Diaz博士和Kevin D. Corbett教授共同撰寫題為“Enzyme used in meiosis makes the cut in vitro”的評述，指出這三項研究代表了減數分裂同源重組領域的"a big break"，開啟了該領域的“a new era of research”。該研究工作得到中國科學技術大學蔡剛教授、分子細胞卓越中心吳薇研究員、李典范研究員、劉珈泉研究員、丁建平研究員、張少慶研究員以及李黨生研究員的大力支持和幫助；分子細胞卓越中心動物實驗技術平臺、生物信息學平臺、中國科學院上海高等研究院國家蛋白質科學研究（上海）設施為該工作提供了支持。該項研究工作獲得國家自然科學基金、科技部、上海市和中國科學院的項目資助。
SPO11-TOP6BL切割DNA后共價連接在DNA的5'端
（a）SPO11-TOP6BL對超螺旋質粒的切割實驗，隨著反應時間增加，質粒逐漸被切割成線性（b）SPO11-TOP6BL對線性DNA的切割實驗，隨著反應時間增加，長的線性DNA逐漸被切割成不同長度的DNA片段（c）添加SDS并不能破壞蛋白和DNA的互作,表明SPO11-TOP6BL切割DNA后共價連接在DNA上（d）hTDP2能破壞SPO11和DNA的互作，表明SPO11與DNA的共價連接通過SPO11的Y138殘基和DNA的5'端之間形成的5'磷酸酪氨酸鍵實現
文章鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08551-1
本文鏈接：我國團隊在體外成功重構DNA雙鏈斷裂的形成http://www.lensthegame.com/show-11-17586-0.html
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